细胞治疗工艺中的质量源于设计

将活体细胞作为治疗药物进行移植的治疗方法为许多急性病和慢性病提供了新型的治疗选择。然而细胞的生物复杂性却限制了细胞治疗从实验室规模放大到可靠、经济的生产规模。我们在这里提出一种应对以上挑战的解决方法——通过质量源于设计(QbD)的原则来设计细胞的生产工艺。QbD将科学知识与风险评估整合到了生产工艺开发中，并已被生物制药工厂所接受。虽然仍需进一步的技术开发才能完全实现，但在细胞治疗生产工艺中存在着大量可以与QbD联合的机会。而通过QbD链接可测分子，细胞群细胞特性与最终产品质量是实现细胞治疗医疗转变的关键步骤。

过去十年使用细胞作为治疗药物的细胞治疗领域得到了空前的增长。虽然第一个造血干细胞移植可以追溯到19世纪50年代，但对于不同适应症的细胞疗法却是随着临床细胞的培养技术突破而从近期才开始的。生产临床应用的细胞治疗产品通常需要以下步骤：获取或生成起始细胞株；培养；改造；收获；浓缩；纯化；制剂，最终罐装（以特定浓度和成分条件制备细胞治疗产品， 分装到最弱产品的“容器”中，以及其它分装后过程）；储存；以及产品运输。虽然这些步骤与从哺乳细胞中生产治疗蛋白的过程是相似的，但因为活体细胞的高度复杂性，对其作用机制的不完全了解，产品性质的不同以及初始材料的多样性使得细胞治疗产品的生产更为挑战。而以上这些严峻的挑战都可以利用QbD来进行解决，而在新的技术方案的放大实现中，产品的研发和生命周期的管理都是监管机构所推崇的。

2002年，美国FDA引进了cGMP倡议来应对药物生产失败追寻其潜在原因时的低效及挑战，并在2006年国际协调会议上概述了QbD的框架，用系统的方法基于科学知识与风险评估来进行工艺和产品管理。今天，随着小分子制药生产对QbD的广泛接受，越来越多的生物制药生产也开始将QbD原则贯彻到它们的工艺中。虽然一些监管机构，如Health Canada， 目前只接受了针对于典型化药和生物药的以QbD为基础的建议书，而在细胞为基础的治疗方法中使用QbD可以极大的提高对工艺和产品的理解和产出。事实上，细胞治疗产品的生物复杂性使QbD的迭代原则尤为贴近于这种治疗方式。

这里我们回顾了主要的QbD概念（BOX 1）并讨论其在四个临床在研细胞治疗产品中的应用：多功能干细胞诱导的心肌细胞，造血干、祖细胞(HSPCs)，间质干细胞(MSCs)和嵌合抗原受体(CAR)-T细胞(表1)。

这四种细胞治疗产品吸引了众多医药公司争相投资。在新兴的PSC诱导的治疗方法中，Ocata Theerapeutics (美国)公司针对致盲症的PSC诱导视网膜细胞疗法已经进入临床实验，目前已经被Astellas Pharma(东京)公司以3.79亿美元收购，Novartis(瑞士)公司投资了3500万美元给Gamida Cell(以色列)公司的脐带血扩增技术，并达成与Regenerex(美国)公司在HSPC产品上的独家许可与合作事宜。2010年Mesoblast(纽约)公司与Cephalon(现在是Teva公司的子公司，以色列)达成了一项20亿美金的MSC技术合作项目。针对恶性疾病的CAR-T细胞疗法是Novaritis与宾州大学(费城)；Pfizer公司(纽约)与Cellectis公司(巴黎)；Amgen公司(美国)与Kite公司(美国）；GlaxoSmithKline公司（伦敦）与Adaptimmune公司(英国)；Celgene公司(美国)与Bluebird公司(美国)；Celgene公司与Juno Therapeutics(西雅图)合作与收购的主题。然而即使这些或其它的细胞疗法已经有了令人兴奋的临床进展，但生产中仍有许多挑战需要克服。QbD提供了一个合理的框架来应对这些挑战并促进细胞疗法作为一种常规治疗选择的实现。如果这些挑战不被解决将导致全行业都无法实现在可控成本条件下生产出高质量的产品，也会影响全球范围内>600个再生医学临床实验的产业化。

应用QbD进行细胞生产

生物反应器系统因其可规模化，易于集成检测技术及可以自动响应来维持环境均一性等特点，成为生产治疗型蛋白所需的细胞培养方法。然而，这些系统是为了获得高蛋白产量而设计的，而不会优先考虑细胞本身。相比之下，细胞治疗产品生产过程中生产出的健康的功能细胞对环境因素有高度的敏感性。许多生物反应器类型，细胞生产模式，规模和控制参数目前已经可以应用于细胞治疗产品生产中(图1)。了解这些不同的“模块”的性能和它们如何应用于细胞治疗产品生产对于QbD是至关重要的，相反也可以应用QbD更深入了解以上要点。

QbD包括产品和工艺描述，表征，设计，监控和持续改进(图2)。而这些都由对基本生物学和某一产品及其工艺工程的深入了解来指导。

QbD由目标产品质量概况(目标产品的质量指标； QTPP)，直接影响产品安全性和有效性的定义属性(关键质量属性)，通过定义这些会影响性能的参数(关键过程参数)和建立设计空间来限制影响质量属性的参数变异。接下来，开发控制策略来保持过程参数在一个范围内来确保产品质量，并且在放大过程中进行工艺验证。相对于传统的基于离散点的控制策略，QbD标识了一个可以生产出高质量产品的可以接受的操作区域或多元设计空间。一旦实施，这个生产工艺被监控且随着对工艺的深入理解可以被不断改进(图3)。

目标产品质量概况(QTPP)

QTPP描述了所需终产品的属性，如一致性，效力和纯度，这也是QbD的起点。我们展示了四个细胞治疗产品的QTPP作为举例(图2)。重要的是，每个细胞治疗产品的一致性，效力和纯度的定义取决于各自使用的疗法。定义严格，标准容易衡量是建立QTPP的关键。

鉴定 对于蛋白和小分子药物，鉴定由分子组成来定义。然而，细胞鉴定(即，表型)是复杂的连续体，通常知之甚少。鉴定通常可以通过细胞表面某种功能活性相关的标志蛋白存在与否来证明，鉴定使用流式细胞术。然而，这种方法可能会遗漏其它由生产工艺或工艺改变引起的表达变化的信息标志。对细胞效力稳定快速的生物分析可以缓解这些担心，但也需要更多的关注标准化鉴定分析。在体内鉴定与血液重构相关的细胞表面标志性质广泛应用到了对造血系统研究中的鉴定上。在一些情况下，多种细胞类型的存在有助于临床，这被反应在鉴定属性上。在2006年，MSC的最小鉴定标准被首次提出，这些细胞主要作为多功能细胞代替治疗被开发出来。如今，热点在于免疫分子联合含有不同性质MSC的更广泛组织来源，而这需要新的鉴定标准来确定治疗相关的分群。在CAR-T工艺中，目标细胞群必须表达嵌合抗原受体（CAR）和正确的T细胞标记。可以用于鉴定产品及区分未转换T细胞和不良的已转入CAR的细胞，随着越来越多特异性CAR被开发出来，开发出可以鉴定非需、与细胞治疗产品共反应的可靠检测将成为必需。

效力 细胞治疗产品不仅要有正确的同一性，他们的功能也必须与体外的功能分析中表现的一致。检验这些功能的关键因素是效力，它能测量药物活性，是评价工艺过程变化所带来的影响的重要手段。测试分泌细胞因子的生物活性将是一种更合适的效价测定方法。在前面的例子，CAR-T细胞破坏靶细胞作为细胞工程的结果，其作用机制能被更好地理解。CAR-T细胞与表达适当的靶抗原细胞在一起孵育可以用来量化T细胞脱颗粒，细胞因子的释放，以及其在体外的增殖和细胞毒性。CAR-T细胞由于具有同一性，单一的检测不能充分定性其多种方式的效力。

效力与力量不同，有剂量依赖性。两种药效等效的药物中，较低强度药物是首选药物。同样，从风险和成本的角度来看，在低强度或可行的细胞密度下，具有高效力的细胞治疗产品是首选。很多方法可用于确定细胞密度和存活力，各有优缺点。制造商应该仔细考虑哪种方法对产品最合适，并确保所获得的数据反映了预期用途。例如，细胞密度和活力往往是通过测量中间代谢活动来间接测量，可以被其他因素影响，包括改变种群构成，线粒体的含量或活性，底物充足、生长介质的氧化还原状态或温度。

纯度 细胞治疗产品的杂质可以包括不合需要的细胞类型，污染，辅助材料和微粒。细胞纯度的阈值在治疗之间有所不同。心肌细胞治疗，移植心肌细胞瞬时节点诱发心律失常，而非心脏细胞与心脏组织没有电磁耦合，也可能导致心律失常。在PSC来源的细胞治疗，仅有1/4000剩余的未分化 PSCs也会导致畸胎瘤。虽然这个阈值低于流式细胞仪检测水平–基于表型分析，最近描述的方法例如对心肌细胞的代谢选择或者抗PSCs的筛选可以大大降低这种风险。，在双脐带造血干祖细胞移植中，T细胞杂质可以引起免疫并发症，虽然T细胞和其他细胞在移植中也有辅助功能。骨髓间充质干细胞是已知的多功能细胞，而在CAR-T细胞疗法，增生性幼稚或中央记忆T细胞在最后CTP（细胞治疗产品）中的比例可能影响疗效。对于基因工程改造获得的细胞治疗产品，纯度分析必须确定所需的改进型细胞的频率，其他类型的细胞，和任何的遗传工程带来的脱靶效应。

细胞培养对各种污染很敏感，显着的微生物（细菌、真菌、支原体）、内毒素和细胞交叉污染，使他们不适合使用。此外，由制造设备和材料所产生的非细胞的颗粒物（包括塑料碎片，残留的载体和纤维）必须被严格控制。CTPS的生产一般需要生物活性物质的鸡尾酒，包括细胞因子、小分子、血清和载体。这些辅助材料必须充分除去，以免被视为药物本身。他们也可以改变其他过程生物可变因素。例如，二甲基亚砜，常用的冷冻保护剂，可以增加增塑剂从生物反应器管道中浸出，和pH值指标可以影响细胞的分化。因此，质量目标产品配置文件必须描述这些辅助材料在最终产品中的最大残留水平以确保其安全性，而且需要有额外的处理以免影响最终的细胞产量。

关键质量属性和关键工艺参数

在开发制造工艺流程时，确定能保证产品质量的决定性属性是必须的。这些关键质量属性可以是物理的，化学的，生物学的，或微生物特性或特征，且应在适当的限度，范围，或分布以保证预期的产品质量。换句话说，关键质量属性是QTPP属性，直接关系到产品的安全性和有效性，包括那些在表2中列出的属性。

关键质量属性受关键工艺参数和原材料属性变化的影响，必须加以控制。关键工艺参数包括细胞功能特征如生长动力学、细胞年龄、细胞分泌的因子或特异基因的表达，而非细胞特征，如原材料属性、物理化学参数（pH、溶解氧、温度）或外源因子的浓度。阐明相关的关键质量属性、关键工艺参数和原料属性，包括进行实验、机制建模、使用先验知识和应用广泛的分析技术。

一旦确定了这些参数和属性，就进行风险评估，按重要性对最有影响的关键工艺参数和材料属性进行研究（图2）。关键质量属性直接决定产品的质量，而关键的工艺参数和材料属性的影响关键质量属性间接影响产品质量。一些关键质量属性可能与可识别的关键工艺参数和材料属性无关（图3）。

关键质量属性指导工艺过程和产品开发，并应随着工艺过程知识的发展而不断改良。早期的工艺发展过程中，一个基础广泛的多参数细胞属性的分析对于确定在以后的开发阶段集中在一组更为明确的的关键参数是有用的。值得注意的是，识别和测量关键质量属性的取值是具有挑战性的。若不首先对关键质量属性有所理解，复杂的多参数研究（“设计空间”下面讨论）可能价值有限，这些研究确定多种参数对关键质量属性的影响。因此，早期CTP的发展应着眼于确定关键质量属性，随着这些基础知识的增长，日益成熟的经验或机制实验模型可以用来探索的关键工艺参数和材料特性的影响。

产品的安全性和有效性受许多过程参数的影响，包括生物反应器系统的操作特性。例如，搅拌不仅可以确保均匀的环境条件也改变剪切敏感的细胞表型。溶氧影响PSCs，HSPCs和间充质干细胞，对效力和纯度有潜在影响。即使轻微的pH值变化也会产生重大影响，如果不加以控制，细胞代谢会降低pH值。代谢副产物也会直接影响结果。例如，乳酸的积累和pH值的降低与细胞生长受抑制和PSC 表型损失有关。媒介交换率和策略（例如，批，分批或灌注）可以用来控制废物和内源分泌因子积累。

CTP生产中使用的反应物不断改进。许多候选的CTPs，来源于复杂的血清基质培养在成纤维细胞上，越来越倾向于通过化学限制性培养基来培养，无异物，cGMP配方，以减少工艺的可变性。然而，起始试剂的可变性（基础培养基、重组蛋白、小分子和起始细胞来源）仍然存在，必须加以量化。减少培养基的组分的策略将减少所需cGMP等级数，减少大量需验证的试剂。生长因子和小分子在小批量临床开发中往往不易获得，而且价格昂贵，生长因子活性变化很大，可能对过程结果产生重大影响。基于标准化和一致的细胞活性检测，或最好是结构敏感的生化检测，以减轻相关风险。

细胞扩大通常是一个经济考虑，但如果它影响CTP质量，可能是一个重要的质量属性.对于病人具有特定性的CTPs，细胞扩大实现的程度可能影响剂量。生产HSPC和CAR-T疗法来源于单一供体的细胞需要足够的细胞扩张以达到靶剂量。相比之下，异源的 CTPs，需要重点考虑细胞老化和稳定性。延长的细胞扩大和酶分离现象也会导致基因异常的累积。细胞数量的从而影响效力（削弱的分化潜能）和纯度（增加的变异细胞）。

细胞信号因子的分泌可能是一个效能属性或一个关键的过程参数。在PSC系统中，自分泌和旁分泌信号是需要的，以维持多功能表型。类似地，向心肌细胞分化的过程中，循环灌注料可以缓解骨形态发生蛋白（BMP）的激动剂和拮抗剂累积所带来的心室样细胞纯度降低。培养HSPC也会有这种情况，分泌型细胞因子的积累是 CTPs质量的主要决定因素，因此也是一个关键的过程参数。相比之下，MSCs通过免疫调节因子的分泌获得疗效，从而代表一个关键质量属性。持续发展的可测量分泌因子的在线传感器系统将提高我们对细胞培养中分泌因子的理解和控制能力。细胞扩大过程取决于起始细胞数量和所用试剂的质量。HSPC扩张产量变化与起始细胞群的表型（CD34 +的分数）非线性相关。筛选系统已发展到可以量化观察PSC分化潜能的可变性；由于捐赠者个体的差异CAR-T细胞治疗在细胞输入量和所输入细胞得组分方面，具有高度的可变性。这些疗法的效力与细胞增殖的相关性最好，疗效可能通过选择特异性细胞亚型而受掌控。在病人特异性的细胞治疗疗法中，捐赠者的差异与同种异源疗法一样，可以通过QbD方法加以系统研究从而控制或减轻这种变异的来源。

产品设计空间

设计空间描述关键工艺参数和关键质量属性材料的交互作用和变化范围，或“正常操作范围”，这与保持产品质量是相容的。关键工艺参数的可变性与CTP生产特别相关，因为输入细胞的可变性和关键工艺参数之间的复杂相互作用，必须相应地加以调整。设计空间内的更改不被视为工艺变更，因为它们对关键质量属性的影响已经被研究并确定是可以接受的。QbD 的这一特征极大地减少了管理机构的负担。FDA的观点是，在可靠的科学数据和健全的质量体系基础上改变设计空间内的操作参数不需要发布通告。此外，定义良好且经过验证的设计空间不需要进行大量的内部测试，因为系统的性能已经得到了描述（只剩下发布测试作为主要测试步骤）。

设计空间是在多因素过程、实验和系统建模的基础上发展起来的。我们举例说明了一个关键工艺参数和一个材质属性的设计空间（图2）。虽然在一个复杂的CTP系统中建立一个高度自信的设计空间是具有挑战性的，有两个互补的工具可以用来指导设计空间开发：实验设计（DOE）和系统建模。

实验设计

DOE描述了一组方法，对于有组织和有结构的科学研究，以理清因素和结果之间的关系。生物反应器的控制下，使得对细胞在响应一系列关键工艺参数的变化后的行为做出系统评价成为可能，从而识别最优操作条件和阐明产品工艺的设计空间。已有的方法可以在统计学上有意义的探索和多参数过程的界定方法涉及到一系列的测试来确定输入变量（单独或组合）对结果的影响。DOE可以用来开发由传统方法逐步优化看起来高不可攀高度的过程，从而增加过程的健强性和成本效率，此外它还可以用来进行综合成本分析。多参数研究将受益于使用新的小规模生物反应器系统来开发关键工艺参数的响应面（方框2）。

基于DOE的相互作用的两个关键工艺参数的影响的调查（播种密度、搅拌速率）对PSC培养确定了工艺优化，逐步实验可能会错过。关于播种密度的相似研究，培养基体积和补料时间使用响应面分析法以确定细胞分裂之后细胞最佳产量的条件。在对HSPC 的研究中，我们早期研究细胞扩大所必需的细胞因子，多个研究采用了DOE方法的探索和优化细胞培养。从造血干细胞产生中性粒细胞，有研究发现此过程受四种细胞因子的交互作用所控制，这一过程如果没有DOE方法不可能被发现，使用细胞因子的简化模型也不可能发现。在对MSC的研究中，初步设计空间已经确定了不同的微载体，细胞接种密度，叶轮几何参数对最终细胞扩大的影响。

DOE必须将关键过程参数不仅与细胞扩大相关的关键质量属性联系起来，而且还要与身份、效力和纯度属性相关联。我们强调的是多参数的调查应该只针对最重要的关键质量属性；过度分析风险识别无关的特性，可能导致对生产过程中的状态信息的误导。随着过程知识的发展，对关键质量属性和关键过程参数的反复评估有助于消除不相关参数的研究。

系统建模

鉴于细胞与环境之间相互作用的复杂性，系统建模将使得开发设计空间获益巨大。大组学数据集提供了构建减少参数的机制模型的出发点，这一模型将关键工艺参数与关键质量属性联系起来（图3）。尽管迄今为止还没有产生过这样的模型，但各种各样的模型技术已被用于整合细胞和生物信号，以预测与CTP生产相关的关键质量属性。干细胞过渡状态的划分模型指导微环境调控和培养补料策略。基于组学数据的代谢途径分析和重建已被广泛应用于优化生物制药生产并适用于CTP生产。这些分析，描述了特定氨基酸对于PSC 培养的关键性，而代谢通量分析已被用于描述在不同的氧水平PSCs 指数生长时代谢通路的活性，以预知培养基的配方。最近，PSCs 来源的心肌细胞不同的乳酸代谢模型已被利用来实现高纯度的心肌细胞，表明基于代谢建模来优化CTP生产是可行的。

随着产品的发展，大量的有价值的数据积累起来。将这些数据关联到关键质量属性，以建立起网络模型达到预测目的技术得以开发。例如，统计工具如多元分析可以识别基因的子集（或其他元素）在组学数据，这些数据与所期待反应有关。这种方法确定了多种样品中的起始和最终的HSPC的种群构成，这一种群构成是一个关键的工艺参数，可被用于作为其他病人特定治疗的起始材料变异性种群构成的参考。基于扩展模型以识别关键过程参数，基于基因表达数据集，模型设计空间的发展，需要与确定关键工艺参数相关的基因调控网络的预测和验证。最近关于输入因子与变化的细胞状态的相关性计算表明，基因调控网络可以链接关键工艺参数和关键质量属性。CTP领域的有价值的下一步是使用建模技术将表型与效力联系起来。

控制策略

过程分析技术是一种设计、测量、监测和控制关键过程参数（包括pH值、溶氧、温度、密度和营养水平）的方法，是QbD的一个重要元素。生物制药的生产工艺使用先进的控制策略实现对工艺变量的在线监测和控制，这些技术同样适用于CTP生产。的确，CTPS与其他生物制剂相比而言增加的复杂性，为更先进的监测和控制策略的创造了一个很好的机会。最近，我们的团队展示了在人类脐带血扩大工艺中，实时监控和控制可溶性信号因子，以增加细胞的产出。分泌因子的测量和控制，细胞群组成和其他先进的工艺参数，这些因素的重要性在细胞疗法中越来越被认可。

QbD的未来应用

尽管CTPs生产的产业化面临诸多挑战，其前景十分乐观。几十年细胞培养产业化工艺设计的经验，提供了在生物反应器的放大和强化，细胞代谢，培养基设计，补料策略优化和工艺过程控制方面的工业化基础。我们对细胞与环境相互作用的理解认识正在提高，能够控制细胞环境的生物反应器系统，正在生成越来越集中于分子和细胞信息的数据集。与此同时，我们对细胞状态的分子基础的认识，包括粘附依赖，代谢网络状态，集落形成和增殖的控制，正在不断提高。虽然我们在此集中讨论的是上游生产工艺过程，QbD对下游操作同样适用。同样，工艺设计只是产品生命周期的一部分，利用这里描述的QbD工具为CTP生命周期创造了灵活可变又经得起检验的工艺。

CTPs的未来取决于细胞生产低成本技术的发展。鉴于CTPs固有的复杂性和它的生产工艺，将今天试验中CTPs转换成广泛使用的药物，QbD方法是必不可少的。